Karier Dylan di dunia seni peran dimulai sejak usianya masih balita. Sprouse bersaudara memulai kariernya pada tahun 1993 di dunia televisi dengan memerankan karakter Patrick Kelly dalam serial Grace Under Fire hingga tahun 1998. Dylan dan Cole juga bergantian memainkan peran yang sama di film komedi legendaris Big Daddy (1999) bersama Adam Sandler.
Namanya makin meledak di seluruh dunia saat membintangi serial Disney Channel, The Suite Life of Zack & Cody dan The Suite Life on Deck, dari tahun 2005 hingga 2008 di mana beradu akting dengan sang kembaran. Selama tampil dalam acara tersebut, Kim Rhodes lawan mainnya mengatakan kalau Dylan sempat jadi sasaran body-shaming karena berat badannya bertambah.
Setelah sempat vakum untuk kuliah di NYU, Dylan tidak buru-buru mengambil proyek komersial besar. Ia memilih terlibat dalam film-film independen, memproduksi komik (Suncatcher). Di tahun 2020, ia kembali menarik perhatian setelah memerankan Trevor di film After We Collided.
Selain berkarier di bidang seni, Dylan juga melebarkan sayapnya dengan membangun bisnis usahanya sendiri di Brooklyn, New York. ia mendirikan bisnis minuman alkohol bernama All-Wise Meadery pada tahun 2018.